Nanopore纳米孔测序技艺

      纳米孔测序技艺如今飞速前行。以Nanopore纳米测序仪为例，它在Nanopore芯片的基质上锚定一个“孔道蛋白”，该蛋白可以和“motor蛋白”结合。“motor蛋白”可以将DNA双螺旋解开成单链，并控制单链借助“孔道蛋白”。当DNA单分子穿过“孔道蛋白”时，不同的碱基会带来不同的电流变化，孔道中的感受器可以感知这种变化。根据电流变化的频谱，适用模式识别算法得到碱基序列
（图1）。

图1 纳米孔测序原理示意图。DNA分子被motor蛋白解螺旋后借助孔道蛋白，产生电流变化。

     仪器特色：
• 实时读取碱基序列，不需要后期融中对测序信号进行二次解读
• DNA/RNA直接测序，RNA不需要经过反转录再测序
• 超长读长，可以达到“M bp”级别
• 高保真度，因为不需要进行PCR扩增，避免了引入突变
• 可以检测碱基修饰
      特色展示1：实时测序
    “Motor蛋白”有两个作用，一个是将捕获的DNA分子进行解螺旋，变成单链分子；另一个是控制单链分子进入纳米孔的速度。当DNA分子上不同的碱基借助纳米孔时，会产生不同的电流变化，这种变化被实时记录下来，然后快速进行数据库检索和匹配，从而解析出对应的碱基类型（图2）。现阶段的测序速度可以达到，DNA 450bp/秒，RNA 70nt/秒。

图2 纳米孔测序仪对碱基序列的实时解读。

      特色展示2：纳米孔测序直接解读RNA中修饰核苷酸
      传统的rRNA基因或rRNA cDNA拷贝的高通量测序（二代测序，方法是SBS）已广阔用于系统发育研究和临床鉴定传染性生物。然而，借助“边合成边测序（SBS）”的方法移除了rRNA的表观遗传修饰信息。纳米孔测序的一个显著长处，是可对天然DNA和RNA进行直接分析并解析碱基修饰。这种直接RNA测序技艺有望快速鉴定环境和患者样本中的微生物。

图3 纳米孔测序仪直接测序RNA。RNA修饰可以作为微生物鉴定的指标，同时纳米孔测序仪的长读长可以帮助提升分类准确性。

      适用范围：
      纳米孔测序仪凭借其超长读长、便捷的建库、实时测序、能进行表观遗传分析等诸多优点，在测序范围逐渐得到广阔的适用。现阶段，在微生物耐药性/致病性，微生物宏基因组，人类遗传学研究，癌症研究，转录组分析等范围，Nanopore测序仪正带来越来越多的研究成果。
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